青海發(fā)光桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.1 材料
菌種：青海發(fā)光桿菌為本實驗室篩選，于-20 ℃保存。
發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，成分為葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加水至1 L，pH值7.0，115 ℃滅菌20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌種活化
將保存的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h,備用。
1.2.2 種子液的制備
從斜面上挑取一環(huán)培養(yǎng)物接種到裝有20 ml 培養(yǎng)液的50 ml 三角瓶中，于30 ℃、220 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h，備用。
1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)
將上述種子培養(yǎng)液按1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量100 ml，于30 ℃、220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h。
1.2.4 培養(yǎng)基的單因素試驗
首先通過PB試驗確定影響芽孢得率的顯著培養(yǎng)基成分，再通過對顯著成分的單因素試驗，確定其*添加量。
1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化
在獲得*培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對接種量以及發(fā)酵模式（震蕩、靜置）進(jìn)行逐一優(yōu)化。
1.2.6 計數(shù)方法
青海發(fā)光桿菌的活菌總數(shù)采用稀釋平板計數(shù)法；芽孢計數(shù)則采用把培養(yǎng)后菌液于80 ℃水浴15 min后稀釋涂平板計數(shù)。
結(jié)果與分析
2.1 不同培養(yǎng)原料對液體發(fā)酵產(chǎn)芽孢能力的影響
在試驗過程中發(fā)現(xiàn)青海發(fā)光桿菌在若干培養(yǎng)基平板上有產(chǎn)芽孢的能力，其中以加入淀粉的平板產(chǎn)芽孢zui早，在24 h產(chǎn)生，以加入蛋白胨的平板為zui高，因此，綜合考慮，我們選擇幾種工業(yè)上發(fā)酵罐中常用的碳氮源作為PB實驗的篩選因子。
試驗?zāi)Ｐ偷腞2值為0.91，表明實驗有91%的數(shù)據(jù)能夠用此模型擬合，模型情況較好。Shapiro-Wilktest表明數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。同時各因素的作用顯著性排序為：蛋白胨>淀粉>大豆粉>葡萄糖>酵母膏>K2HPO4>(NH4)2SO4。其中顯著的因素為蛋白胨、大豆粉和淀粉。
2.2青海發(fā)光桿菌形成培養(yǎng)基的確定
根據(jù)2.1 節(jié)所獲得的結(jié)果，我們選擇了蛋白胨、淀粉和大豆粉等3個因素為考察對象，其余因素取低水平。對此3因素進(jìn)行單因素實驗，摸索它們的*添加量。
淀粉*的添加量為0.2%、蛋白胨*添加量為0.5%、大豆粉*添加量為1.0%，結(jié)合2.1節(jié)的結(jié)果，確定青海發(fā)光桿菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的*培養(yǎng)基為淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。
2.3 接種量的單因素實驗
在確定發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了初始種子接種量對發(fā)酵后芽孢數(shù)的影響。
隨著初始種子接種量的增加，發(fā)酵后的芽孢數(shù)量也逐步提高，考慮到實際，合理的接種量應(yīng)該控制在3%~5%。
2.4 不同的培養(yǎng)方式對青海發(fā)光桿菌得率的影響
研究表明，提高通氣量有助于青海發(fā)光桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?，而靜置培養(yǎng)又可提高初始菌數(shù)。因此我們選取了3種不同的作用方式。*的培養(yǎng)方式為連續(xù)搖瓶的方式，在此條件下，芽孢數(shù)量可以達(dá)到3.5×108 cfu/ml。