抗體稀釋液

    其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了*防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因，我一直用國(guó)產(chǎn)的抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒(méi)有結(jié)合），zui后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）

    為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
注意：

①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。

②溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；

③沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。

④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）

DAB顯色

    背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（一抗4℃）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。