1)訓(xùn)練目的

    了解細(xì)胞活性檢查的原理；掌握染料的配制方法；掌握細(xì)胞活性檢查方法。

2)實(shí)驗(yàn)原理

    細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，某些染料可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。常用的染料有臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑、結(jié)晶紫。

3)實(shí)驗(yàn)材料

①臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑、結(jié)晶紫溶液(溶于Hank's液或BSS液)。

②冷凍復(fù)蘇后的細(xì)胞或其他培養(yǎng)細(xì)胞。

③研缽、濾紙、漏斗、試劑瓶、標(biāo)簽紙、顯微鏡、膠頭滴管、鑷子、載玻片、蓋玻片、計(jì)數(shù)器。

4)操作步驟

(1)配制染色液

①0.5％臺(tái)盼藍(lán)法：0.5g臺(tái)盼藍(lán)加熱溶于100 mLHank's液或BSS液中，貼標(biāo)簽。

(1)0.05％苯胺黑：0．05 g苯胺黑充分研磨后溶于100 mL Hank's液或BSS液中。苯胺黑對(duì)細(xì)胞毒性小，但溶解度差．配制后需過(guò)濾，貼標(biāo)簽。

③0.1％結(jié)晶紫(用BSS液配制)法：0.1g結(jié)晶紫分別研磨溶于．100mL Hank's液或BSS液中，過(guò)濾后貼標(biāo)簽。

(2)制備細(xì)胞懸液

調(diào)整細(xì)胞濃度在1×106個(gè)／mL左右。

(3)染色

①0．5％臺(tái)盼藍(lán)法：取少量細(xì)胞懸液，按l：1量加入0．5％臺(tái)盼藍(lán)染色液，充分混勻。靜置15 min，用膠頭滴管吸取細(xì)胞懸液，滴1滴于載坡片上，加蓋玻片。1 min后用10x物鏡移動(dòng)視野觀察，計(jì)數(shù)100～200個(gè)細(xì)胞。活細(xì)胞圓形透明，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力。

②0．05％苯胺黑法：使用時(shí)，苯胺黑液與細(xì)胞懸液以1：10混合，稍放置后鏡檢，死細(xì)胞染成黑色，活細(xì)胞不著色。

③0.1％結(jié)晶紫法：細(xì)胞懸液與結(jié)晶紫液等量混合后，立即鏡檢，著紫色的為活細(xì)胞。

5)注意事項(xiàng)

①染色時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則活細(xì)胞也會(huì)逐漸積累染料而染成顏色，使檢測(cè)結(jié)果偏低。

②可結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)。

③細(xì)胞活性檢查是細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)。它是檢測(cè)不同藥物、生化物質(zhì)處理等效果的直觀簡(jiǎn)便手段，也是評(píng)定細(xì)胞冷凍效果的方法之一。在細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過(guò)程中，由于細(xì)胞遭受非生理性的低溫打擊等，不可避免地對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，引起部分細(xì)胞活力下降或死亡，通過(guò)細(xì)胞活性檢查可快速檢驗(yàn)細(xì)胞冷凍效果，是衡量細(xì)胞凍存、復(fù)蘇效果的一種簡(jiǎn)便易行的方法：染料排除法是檢查細(xì)胞活性常用的方法。

④檢查貼壁的細(xì)胞時(shí)，應(yīng)先將細(xì)胞消化然后再進(jìn)行操作。